Egy új, alacsony költségű, papíralapú májfunkciós pont-ellátási rendszer

ABSZTRAKT

A májkárosodás kvantitatív értékelésének egyik fontos eszközeként a biokémiai analizátor egy hagyományos vizsgálati módszer. Azonban az alacsony-közepes jövedelmű országokban (LMIC) nem terjedt el széles körben a korlátozott személyzet, a finanszírozás hiánya és a bonyolult környezeti problémák miatt. A májkárosodással kapcsolatos információk gyors és hatékony megszerzése egyszerű és hatékony módszerrel, amely hatékonyan támogatja a klinikai döntéshozatalt, továbbra is kihívást jelent a LMIC országok számára. A probléma megoldása érdekében egy új és könnyen használható, a májkárosodást vizsgáló rendszert terveztünk. Ez a rendszer egy kétfotonos makrofotokémiai érzékelőn alapuló érzékelő eszközből és egy beépített vérsejt-szűrési rendszerrel ellátott papír alapú tesztkártyából áll. A kétfotonos szerkezet csökkenti a rendszer teljes térfogatát és költségét, kompenzálja a műszer összeszerelési folyamata során fellépő állomások közötti hibákat. A vérsejt-szűrési rendszer csökkenti a működési bonyolultságot, és a vér közvetlenül a tesztkártyán szűrhető, reagáltatható és színe megváltoztatható. A érzékelő eszköz a papíralapú tesztkártya folyamatos fényvisszaverődési jelét veszi, és számszerűsíti a jelet a májkárosodási indexek kvantitatív vizsgálatának elvégzéséhez. A rendszer teljesítményének értékeléséhez a közepes jövedelmű országok országos környezetét szimuláltuk: 35 ℃-os hőmérsékleten és 90%-os relatív páratartalom mellett, 40 heparinos teljes vérrel a korrelációs R² Rendszerünk és a MindrayBS350s között a variációs együttható (CV) nagyobb volt, mint 0,95. Mind a Randox Quality Control 2., mind a 3. szintű ismételhetőségi variációs együtthatója (CV) 7,5% alatt volt. Az eredmények azt mutatják, hogy a rendszer nemcsak kis méretű, alacsony költségű és egyszerűen kezelhető, hanem mérési teljesítménye és stabilitása is megfelel a magas hőmérsékletű és magas páratartalmú környezet klinikai követelményeinek, így alacsony és közepes jövedelmű országokban (LMIC) alkalmazható primer májfunkciós szűrésre és májbetegség progressziójának értékelésére.

Kulcsszavak: Reflexiós spektrum; Fotokémiai érzékelő; Többjeles feldolgozás; Májkárosodás gyors kimutatása; POCT analizátor; LMIC-k

1. BEVEZETÉS

A májbetegségek hatalmas terhet jelentenek a globális közegészségügy számára, évente több mint 2 millió ember halálát okozva világszerte.^1,2Ezen halálesetek nagy része időben történő diagnózissal és kezeléssel kezelhető (például krónikus hepatitis B), gyógyítható (például krónikus hepatitis C) vagy megelőzhető (például gyógyszer okozta májelégtelenség).³A májbetegségek diagnosztizálását jelenleg nem invazív módszerekkel végzik, beleértve az ultrahangot és az azonnali elasztikus képalkotást, valamint a vér biokémiai markereinek mérését. Ezek a diagnosztikai technikák azonban kifinomult berendezéseket és jól képzett személyzetet igényelnek, amelyek gyakran nem állnak rendelkezésre a korlátozott erőforrásokkal rendelkező alacsony-közepes jövedelmű országokban (LMIC), ami nagyon megnehezíti a májkárosodás felismerését, diagnosztizálását és monitorozását.^4-7Ennek következtében sok embernél a betegség előrehaladott stádiumáig nem diagnosztizálják a betegséget, ami jelentős késedelmekhez vezet a klinikai döntéshozatalban, és jelentős költségekkel jár a későbbi kezelés. Számos tudós felismerte a májbetegségek felismerésének problémáját a közepes jövedelmű országokban.³, és rámutatott arra, hogy sürgősen szükség van egy gyors, hatékony és hordozható módszer kidolgozására a májfunkciós károsodás gyors mérésére ezekben az országokban.

*liyingchun@konsung.com;

Az alanin-aminotranszferáz (ALT), az aszpartát-aminotranszferáz (AST) és az albumin (ALB) három biomarkerét gyakran használják a májkárosodás klinikai kimutatásában, ezek közül az egyik vagy mindegyik emelkedése a leggyakoribb kóros jelenség a májfunkciós vizsgálatok során. Az ALT, AST és ALB kimutatása felhasználható a májkárosodás előzetes megítélésére és a májbetegségek progressziójának értékelésére.^8-13Jelenleg kétféle, FDA által jóváhagyott klinikai kémiai eszköz létezik a májfunkció vizsgálatára, amelyeket általában alacsony és közepes jövedelmű országokban használnak: az LDXH (Alere, San Diego, Kalifornia) és a Roche ReflotronH Plus (Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana). Ez a kétféle eszköz képes az ALT és az AST mérésére ujjbegyből vett vérből a szérum elválasztása nélkül. A korlátozott erőforrásokkal rendelkező alacsony és közepes jövedelmű országok számára azonban ez túl drága (a berendezések 3000-6000 amerikai dollár, a tesztdarabok >4 amerikai dollár).¹⁴ és bonyolult alkalmazni, ami jól képzett technikusokat, stabil tápegységet és egyszerre csak egy jelölő tesztelését igényli.

Kifejlesztettünk egy gyors detektáló platformot és tesztkártyát az ALT, AST és ALB pont-pont mérésére reflexiós fotometria alapján, amely alkalmas az alacsony és közepes jövedelmű országok környezetébe, nagy előnyeivel: alacsony költség, egyszerű kezelhetőség, teljes vér/ujjbegyből vett vérvizsgálatok elvégzésének képessége és a laboratóriumi tápegységtől való függetlenség. Ez egy hordozható Point of Care Testing (POCT) tesztrendszer, amely egy POCT analizátort és a hozzá tartozó papír alapú tesztkártyát tartalmaz. A rendszer használatával a mérendő vér egy adott régióba vezethető, és fokozatosan befejeződik a vérsejtek szűrése, majd enzimhez kötött reakció és színvisszaadás következik be. Végül a POCT eszközzel kapott papír alapú tesztkártya reflexiós spektrumgörbéjét számszerűsítjük, majd meghatározzuk az ALT, AST és ALB koncentrációját. Az eszköz alacsony költségének, könnyű hordozhatóságának, korlátlan vizsgálati helyszínének és gyorsaságának nagy előnyei elősegítik a májbetegségek klinikai szűrésének, értékelésének és kezelésének bővítését és decentralizálását az alacsony jövedelmű országokban, és ez a rendszer hatékony támogatást nyújt a korlátozott gazdasági erőforrásokkal rendelkező alacsony jövedelmű országokban végzett széleskörű vizsgálatokhoz.

2. MÓDSZEREK

2.1 Alapelvek
Ez a rendszer a Kubelka-Munk elméleten (KM-elmélet) alapul. A KM-elméletet általában gyengén abszorbeáló mintákból kapott diffúz reflexiós spektrumok elemzésére használják, összefüggést mutatva a reflexió és a koncentráció között. Az abszorbeáló anyag koncentrációja a Kubelka-Munk képlettel határozható meg:
 

Ahol R = reflexió, k = abszorpciós együttható, s = szórási együttható, c = az abszorbeáló anyag koncentrációja és A = abszorbancia¹⁵.

A vér reakcióba lép a rendszer papíralapú tesztkártyájának tesztterületén, ami színváltozást eredményez, és a változás mértéke arányos a kapcsolódó koncentrációkkal. A KM-elmélet szerint azonos anyagú és vastagságú tesztdarabok sorozata esetén, amelyeket ugyanazon fényforrás világít meg, k arányos lesz az anyagkoncentrációval c, F(R) arányos c-vel, majd az abszorpciós anyag koncentrációja a visszaverődés értékével számszerűsíthető.


2.2 Papíralapú májfunkciós tesztek
A papíralapú tesztkártyák több réteg mintázott papírból készülnek (1. ábra), amelyek mindegyikének más funkciója és anyaga van. A papír többrétegű rétegeit függőlegesen kombinálják/rögzítik polimer anyagokkal, így reagens tesztkártyát alkotnak. A felső réteg izotróp hidrofil gézt használ, amely egy mikrofluidikus hidrofil útvonalat képez, amely a vért a kijelölt detektálási régióba irányítja a plazma elválasztása és tesztelése céljából. A tesztkártyán négy független régió található, amelyek közül három tesztterület, amelyek az ALT, AST és ALB mérésére szolgálnak; a fennmaradó egy egy kivételazonosító régió, amely biztosítja az eszköz normál működését. Mind a négy zóna egyedi környezettel rendelkezik (például reagensek, pufferek, indikátorok), hogy a mérési folyamat gyors és egymástól független legyen. Ezzel a rendszerrel a minta hozzáadásától a reakció befejezéséig eltelt teljes idő kevesebb, mint 3 perc. Az ALT és AST mérése peroxidáz módszeren alapul.¹⁶és a brómkrezolzöld módszeren alapuló ALB¹⁷Az analizátor a tesztkártya színváltozásának rögzítésével számszerűsíti a mérendő anyag koncentrációját.^18,19.

1. ábra. A papíralapú tesztkártya (bal oldali) szerkezete, valamint a tesztkártyák színváltozása az ALB, AST és ALT esetében 3 perccel a minta hozzáadása után.

2.3 Alacsony költségű, ellátáshelyen elérhető májfunkciós tesztplatform
A POCT eszköz a papíralapú tesztkártyák színváltozásainak rögzítésére és koncentrációs kimenetekké alakítására szolgál. Az eszköz mintavételező modult, fotoelektromos érzékelő modult, jelelemző modult, tápegység modult és kijelző modult tartalmaz, és minden modul különállóan lett kialakítva a könnyű karbantartás érdekében. A mintavevő modul a tesztkártya rögzítésére szolgál, a fotoelektromos modul pedig különféle információk gyűjtése és az optikai információk elektromos jelekké alakítása. A papíralapú tesztkártya mintavevő modulba helyezése után a vércseppek hozzáadódnak. A vér belép a papíralapú tesztkártyába, vér-pép elválasztási és kémiai reakción megy keresztül, majd a keletkezett színváltozásokat a POCT eszköz fotoelektromos érzékelő modulja rögzíti. A jelelemző modul jel-koncentráció konverziós modellje segítségével az ALT, AST és ALB koncentrációit rögzíti, és végül a kijelző modul megjeleníti.

A POCT eszközök magját képező fotoelektromos detektáló modulhoz kifejezetten egy 4 csatornás, mikro-két-foton kettős fényforrású, diffúz fotokémiai érzékelőt terveztünk, amely mindössze egy érme méretű. Minden csatorna 2 különböző hullámhosszúságú fényforrásból, 2 azonos hullámhosszúságú fényforrásból és 1 fényérzékelőből áll, ahogy a 2. ábra mutatja. A hagyományos biokémiai berendezésekkel ellentétben az itt használt mikro-fotokémiai érzékelő alacsony energiafogyasztású, és lítium akkumulátoros tápellátásának köszönhetően mentes a hagyományos tápegységtől. Így az eszköz hordozhatósága és alkalmazhatósága is javul. Miután a kettős fényforrás által kibocsátott fényt a lencse feldolgozta, az megvilágítja a mérendő tárgy felületét. A tárgyról visszavert fényt a lencse feldolgozza, majd elektromos jellé alakítja, és a hullámhossz függvényében rögzíti. Ekkor az érzékelő a bal és jobb oldali fényforrásokból érkező jelek szuperpozícióját veszi, és a visszavert jelet felerősíti. Mivel a két fényforrás közötti távolságot előre úgy tervezték, hogy a hozzájuk tartozó visszavert jelek kiegészítsék egymást, ennek a kialakításnak köszönhetően a műszer összeszerelési folyamata során a távolsághiba által okozott jelkülönbség a különböző állomások között minimálisra csökkenthető, így nincs szükség kalibrálásra a különböző berendezések között, ami csökkenti a gyártási költségeket, ugyanakkor a berendezés karbantartása a gyárból való kiszállítás után egyszerűbbé és kényelmesebbé válik.

2. ábra. A fotoelektromos detektáló modul és az egycsatornás kétfotonos makro fotokémiai érzékelő vázlatos rajza.

2.4 Tanulmányterv
Annak érdekében, hogy ellenőrizzük a berendezés alkalmazhatóságát alacsony és közepes jövedelmű országokban (LMIC), teszteltük a teljes vérmérés pontosságát és a Randox Quality Control megismételhetőségét 90%-os relatív páratartalom mellett, 35°C-on. A teljes vérmintákat, a heparin-nátrium teljes vért, 2023 májusában gyűjtöttük a Zhenjiang-i harmadik népi kórházban. A mintákat két példányra osztottuk, az egyiket centrifugáltuk, majd MindrayBS350s (Mindray, Shenzhen, Kína) gépen teszteltük normál hőmérsékleten, a másikat a jelen cikkben javasolt POCT rendszerrel teszteltük 90%-os relatív páratartalom mellett, 35°C-on, és az eredményeket rögzítettük. Itt a Randox Quality Control (Randox, Észak-Írország, Egyesült Királyság) 2. szintjét (1503UN tétel) és 3. szintjét (1223UN tétel) teszteltük 35°C-on és 90%-os relatív páratartalom mellett POCT analizátorral, illetve tesztkártyákkal, tízszer.

2.5 Statisztikai elemzés
Az adatelemzést és a regressziós diagramok generálását Excel2013 programmal végeztük. A regressziós diagramokat ábrázoltuk, és a korrelációs együttható R² A vizsgálatban használt rendszer és a MindrayBS350s között megfigyelt eredmények közötti különbségekre számítottuk ki a értéket, a mérési teljesítmény értékeléséhez pedig a variációs koefficienst (CV) számítottuk ki.

3. EREDMÉNYEK

3.1 Működési feltételek és a vizsgálat teljesítménye
A heparinnal kezelt vér 40 esetében a korreláció, R²Az ALT, AST és ALB értékek MindrayBS350s készülékkel történő mérése 0,9909, 0,9918 és 0,9913 volt 35°C-on és 90%-os relatív páratartalom mellett, ahogy a 3. ábra mutatja. A három tétel R2 értéke mind nagyobb volt, mint 0,95, ami azt jelzi, hogy az eszköz és a kiegészítő reagensek eredményei jól korreláltak a MindrayBS350s klinikai biokémiai eszköz eredményeivel ebben a környezetben.

3. ábra. A MindrayBS350s-szel való korreláció a teljes ALT, AST és ALB tekintetében 35°C-on és 90%-os relatív páratartalom mellett.

3.2 Pontosság
A tételen belüli pontosság a tételen belüli mérési hibát, más néven megismételhetőséget jelzi, amelyet ugyanaz a kezelő ismételten meghatároz ugyanazon a mintán. 35°C-on és 90%-os relatív páratartalom mellett a berendezés és a tesztkártyák pontosságát Randox minőségellenőrzéssel értékelik annak ellenőrzésére, hogy a környezet elhanyagolható véletlenszerű hibákat okoz-e. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja, a Randox minőségellenőrzés ALT 2. szintű variációs együtthatója 5,8%, 3. szintű 4,5%; AST 2. szintű variációs együtthatója 6,5% és 3. szintű variációs együtthatója 2,5%. Az ALB 2. szintű érték 5,7%, 3. szintű 7,3%. Az ALT és az AST megfelel a kínai szárazvegyszer-elemző ipari szabványnak.²⁰Az ALT és AST variabilitási együtthatója 40U/L~60U/L koncentrációtartományban legfeljebb 12%, a variációs együttható pedig 100U/L~300U/L koncentrációtartományban legfeljebb 5%; A fenti analitok mindegyike megfelel a piacon lévő legtöbb száraz biokémiai POCT analizátor kézikönyvében felsorolt, 7,5%-nál kisebb variációs együtthatóra vonatkozó követelménynek. Az eredmények azt mutatják, hogy 35°C és 90%-os relatív páratartalom mellett a berendezés és a tesztkártya variációs együtthatója az elfogadható tartományon belül van, és a tesztkártya véletlenszerű hibája ilyen környezetben elfogadható.
 
1. táblázat: ALT, AST és ALB Randox minőségellenőrzési kísérlet és az eredmények.

4. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

A biokémiai analizátorokat évtizedek óta használják az előnyben részesített módszerként a máj hematológiai markereinek, például az ALT, az AST és az ALB kimutatására. Az emberi perifériás vénás vér levétele után egy központi laboratóriumba szállítják, ahol a szérumot képzett technikusok elválasztják és biokémiai analizátorral tesztelik. Ezek a látszólag rutinszerű kimutatási módszerek nagyon nehezek az alacsony és közepes jövedelműek számára, mivel: drága berendezések, stabil vizsgálati környezet szükséges, valamint jól képzett technikusok a vizsgálatok elvégzéséhez és a szükséges karbantartáshoz. Továbbá, bár a kimutatás elvégezhető, az LMIC-k szétszórt környezete késlelteti a kimutatási eredményeket.

Ebben a cikkben egy alacsony költségű, gyors májkárosodási indexek detektálására alkalmas rendszert tervezünk. Összehasonlítjuk a meglévő POC-eszközökkel és a korábban publikált tanulmányokkal. ^{21, 22, 23}POCT készülékeink képesek egyidejűleg kvantitatív ALT, AST és ALB teszteket végezni. Az alacsony energiafogyasztás és a lítium akkumulátor kialakítása lehetővé teszi, hogy a kapcsolódó tesztek bármikor és bárhol elvégezhetők, függetlenül a vizsgálati helyszín áramellátásától. Mivel a perifériás vér közvetlenül vizsgálható, nincs szükség bonyolult centrifugálási folyamatra a vizsgálat előtt. A háziorvosok egyszerű képzés után jól el tudják végezni a tesztet. A költség 0,95 volt, a Randox minőségellenőrzésének megismételhetősége pedig

Összefoglalva, a jelen cikkben javasolt POCT analizátor és a hozzá tartozó reagensek vagy tesztkártya a következő előnyökkel rendelkezik:
1. Az alapellátásban dolgozók egyszerű képzéssel használhatják a készüléket; 2. A papíralapú rendszer könnyen kezelhető és karbantartható; 3. A három kvantitatív vizsgálat, az ALT, az AST és az ALB, egyszerre tesztelhető, a vizsgálati idő 3 percen belül van, a vértérfogat pedig

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A működési körülmények és a vizsgálati teljesítmény ezen tanulmányban szereplő tanulmányozását az Innovatív Új Diagnosztika Alapítványa (FIND) finanszírozta.

REFERENCIÁK

[1] Byass, P., „A májbetegség globális terhe: kihívás a módszerek és a közegészségügy számára”, BMC Med. 12(2014).
[2] Marcellin P., Kutala BK, „Májbetegségek: egy jelentős, elhanyagolt globális közegészségügyi probléma, amely sürgős intézkedéseket és nagyszabású szűrést igényel”, Liver Int 38 Suppl. 1: 2-6 (2018).
[3] Moed S, Zaman MH, „A májkárosodás jobb diagnosztikai eszközei felé az alacsony és közepes jövedelmű országokban”, BMJ Global Health. 4: e001704(2019).
[4] Yadav, H., Shah, D., Sayed, S. és mások: „Alapvető diagnosztikai eszközök elérhetősége tíz alacsony és közepes jövedelmű országban: a nemzeti egészségügyi intézmények felméréseinek eredményei”, The Lancet Global Health. 9(11): e1553-e1560(2021).
[5] Fleming, KA. Horton, S., Wilson, ML, Atun, R. és mások: „A Lancet diagnosztikai bizottsága: a diagnosztikához való hozzáférés átalakítása”, The Lancet. 398:1997-2050(2021).
[6] Reipold, EI, Trianni, A., Krakower, D. és mások: „Értékek, preferenciák és a jelenlegi hepatitis B és C tesztelési gyakorlatok alacsony és közepes jövedelmű országokban: a végfelhasználók és a végrehajtók körében végzett felmérés eredményei”, BMC Infectious Diseases. 17(1):149-157 (2017).
[7] Cainelli, F., „Májbetegségek a fejlődő országokban”, World J Hepatol. 4(3): 66-67 (2012).
[8] Dufour DR, Lott JA, Nolte FS és munkatársai: „A májkárosodás diagnosztizálása és monitorozása. II. Ajánlások a laboratóriumi vizsgálatok szűrésben, diagnózisban és monitorozásban történő alkalmazására”, Clin Chem. 46(12): 2050–2068(2000).
[9] Whitehead MW, Hawkes ND, Hainsworth, I. és munkatársai: „A máj eredetű, jelentősen megemelkedett aszpartát-aminotranszferáz-szint okainak prospektív vizsgálata”, Gut. 45(1):129–133(1999).
[10] Daniel, S., Ben-Menachem, T., Vasudevan G. és munkatársai: „Megmagyarázhatatlan krónikus májtranszamináz-eltérések prospektív értékelése tünetmentes és tünetekkel járó betegeknél”, Am J Gastroenterol. 94(10):3010–3014(1999).
[11] McLernon, DJ, Donnan, PT, Sullivan, FM és munkatársai: „Májbetegség előrejelzése olyan betegeknél, akiknek májfunkciós tesztjeit az alapellátásban ellenőrizték: modellfejlesztés és validálás populációalapú megfigyeléses kohorszok felhasználásával.” BMJ Open. 4(6): e004837(2014).
[12] Doumas, BT, Peters Jr, T., „Szérum- és vizeletalbumin: haladásjelentés mérésükről és klinikai jelentőségükről”, Clinica Acta. 258(1):3-20(1997).
[13] Newsome, PN, Cramb, R., Davison, SM, „Útmutató a kóros májfunkciós vérvizsgálati eredmények kezeléséhez”, Gut. 67: 6-19 (2018).
[14] Pollock, NR, Rolland, J. P, Kumar, S. és munkatársai: „Papíralapú multiplexált transzamináz teszt alacsony költségű, a betegellátás helyén végzett májfunkciós vizsgálatokhoz”, Sci Transl Med. 4: 152ra129 (2012).
[15] Kubelka, P., Munk, F., „Hozzájárulás a festékbevonatok optikájához”, Physik. 12: 593-601 (1931).
[16] Long, LH, Halliwell, B., „Műtárgyak sejtkultúrában: az α-ketoglutarát képes megkötni az aszkorbát és az epigallocatechin-gallát által termelt hidrogén-peroxidot sejtkultúra-közegben.” Biochemical and Biophysical Research Communications. 406:20-24(2011).
[17] Wells, F. E, Addison, G. M, Postlethwaite, RJ, „Albuminanalízis hemodialízisben részesülő betegek szérumában: eltérések a brómkrezollila, a brómkrezolzöld és az elektroimmunvizsgálat között”, Ann Clin Biochem. 22: 304-309 (1985).
[18] Giusti, G., Ruggiero, G., Cacciatore, L., „Néhány spektrofotometriás és kolorimetriás eljárás összehasonlító vizsgálata a szérum glutamát-oxaloecetsav és glutamát-piruvát transzamináz májbetegségekben történő meghatározására”, Enzymol Biol Clin. 10(1):17-38(1969).
[19] Rodgerson, DO, Osberg, IM, „A szérum aszpartát-aminotranszferáz és alanin-aminotranszferáz aktivitásának spektrofotometriás mérésének hibái”, Clin Chem. 20: 43-50 (1974).
[20] CFDA, „YYT 0655-2008 Szárazkémiai analizátor”, 1-8(2008).
[21] Chang, KS, Chang, CK, Chou, SF és mások, „Aminotranszferáz aktivitások szekvenciális mérése amperometrikus bioszenzorokkal”, Biosensors and Bioelectronics. 22(12): 2914-2920(2007).
[22] Thuy, T., Tseng, T., Thuy, TNT és mások: „Mikroplatina drót bioszenzor az alanin-aminotranszferáz gyors és szelektív kimutatására”, Sensors. 16(6):767-781(2016).
[23] Jain, S., Rajasingham, R., Noubary, F. és munkatársai: „Optimalizált, papíralapú teszt teljesítménye az alanin-aminotranszferáz (ALT) gyors vizuális mérésére ujjbegyből és vénából vett mintákban”, PLoS One. 10:1-15(2015).